直擴(kuò)/直接PCR——Direct PCR，一種不需要額外提取DNA就能夠?qū)崿F(xiàn)體外DNA擴(kuò)增的技術(shù)，省去提取基因組DNA的繁瑣程序，可以直接應(yīng)用于PCR的快速檢測。直擴(kuò)PCR最早應(yīng)用的領(lǐng)域是動植物領(lǐng)域，比如鼠、貓、雞、兔、羊、牛等動物的血液、組織和毛發(fā)；植物的葉片和種子等，用來研究基因分型、轉(zhuǎn)基因、質(zhì)粒檢測、基因敲除分析、DNA來源鑒定、物種鑒定、SNP分析等領(lǐng)域。

這些領(lǐng)域有一些共同的特點(diǎn)，那就是目標(biāo)基因的含量比較高，核酸提取麻煩，所以直擴(kuò)PCR不僅能夠節(jié)省時(shí)間，對結(jié)果的影響很小，同時(shí)也能節(jié)省成本。本文就一起來了解一下直擴(kuò)PCR技術(shù)的使用場景及常見問題。

在做分子實(shí)驗(yàn)時(shí)，什么情況下建議使用直擴(kuò)PCR而不是常規(guī)PCR呢？

1.只需要提取樣品基因組DNA進(jìn)行PCR、分子克隆等實(shí)驗(yàn)，不需要長期保存DNA。如基因型鑒定、CRISPR-Cas9陽性鑒定等；

2.樣品量較大時(shí)，做PCR鑒定需要保存陽性樣本基因組DNA，也可使用Direct PCR進(jìn)行樣本初步篩選，有利于節(jié)約時(shí)間、成本；

3.樣本量較少，無法使用基因組提取試劑盒提取的樣品也可嘗試此方法。

直擴(kuò)PCR常見問題與解決辦法

Q1：擴(kuò)增無目的條帶？

A1：

1） 樣品

a．裂解樣品過多。建議按照說明書取樣進(jìn)行裂解；

b．樣品中抑制成分濃度過高。釋樣品后再取適量作為模板。

2） 引物

a．引物設(shè)計(jì)不合理；

b．引物降解；

建議用提取的DNA樣品作為對照，用試劑盒陽性引物對照進(jìn)行試驗(yàn)，重新設(shè)計(jì)引物。

3）  程序：

a．PCR擴(kuò)增程序不合適。調(diào)整PCR程序（優(yōu)化退火溫度：使用降落PCR，梯度PCR，增加循環(huán)數(shù)至35~40個(gè)循環(huán)、延伸時(shí)間增加等）。

Q2：擴(kuò)增出現(xiàn)非特異條帶？

A2：

1） 引物：

a．引物設(shè)計(jì)不合理。重新設(shè)計(jì)引物（從引物5’端延長引物至25~30bp，Tm值65~67℃）；

b．引物濃度過高。降低引物濃度。

2）樣品

a．裂解樣品過多。建議按照說明書取樣進(jìn)行裂解；

b．樣品中抑制成分濃度過高。釋樣品后再取適量作為模板。

3）  程序：

a．退火。優(yōu)化退火溫度，使用降落PCR，梯度PCR；

b．延伸。減少延伸時(shí)間；

c．循環(huán)數(shù)。降低循環(huán)數(shù)。

本期內(nèi)容：直擴(kuò)PCR技術(shù)的使用場景及常見問題

下期內(nèi)容：polyscience轉(zhuǎn)染試劑介紹